PCR產(chǎn)物的電泳檢測時(shí)間一般為48h以?xún)龋行┯诋斎针娪緳z測，大于48h后帶型不規則甚致消失。
假陰性，不出現擴增條帶
 PCR反應的關(guān)鍵環(huán)節有:
 ①模板核酸的制備;
 ②引物的質(zhì)量與特異性;
 ③酶的質(zhì)量及活性;
 ④PCR循環(huán)條件。
尋找原因亦應針對上述環(huán)節進(jìn)行分析研究。
 模板：
 ①模板中含有雜蛋白質(zhì)；
 ②模板中含有Taq酶抑制劑；
 ③模板中蛋白質(zhì)沒(méi)有消化除凈，特別是染色體中的組蛋白；
 ④在提取制備模板時(shí)丟失過(guò)多，或吸入酚；
 ⑤模板核酸變性不*。
在酶和引物質(zhì)量好時(shí)，不出現擴增帶，極有可能是標本的消化處理，模板核酸提取過(guò)程出了毛病，因而要配制有效而穩定的消化處理液，其程序亦應固定不宜隨意更改。
  酶失活：需更換新酶，或新舊兩種酶同時(shí)使用，以分析是否因酶的活性喪失或不夠而導致假陰性。需注意的是有時(shí)忘加Taq酶或溴乙錠。
  引物：引物質(zhì)量、引物的濃度、兩條引物的濃度是否對稱(chēng)，是PCR失敗或擴增條帶不理想、容易彌散的常見(jiàn)原因。有些批號的引物合成質(zhì)量有問(wèn)題，兩條引物一條濃度高，一條濃度低，造成低效率的不對稱(chēng)擴增，對策為：①選定一個(gè)好的引物合成單位；②引物的濃度不僅要看OD值，更要注重引物原液做瓊脂糖凝膠電泳，一定要有引物條帶出現，而且兩引物帶的亮度應大體一致，如一條引物有條帶，一條引物無(wú)條帶，此時(shí)做PCR有可能失敗，應和引物合成單位協(xié)商解決。如一條引物亮度高，一條亮度低，在稀釋引物時(shí)要平衡其濃度;③引物應高濃度小量分裝保存，防止多次凍融或長(cháng)期放冰箱冷藏部分，導致引物變質(zhì)降解失效;④引物設計不合理，如引物長(cháng)度不夠，引物之間形成二聚體等。
　　Mg2+濃度：Mg2+離子濃度對PCR擴增效率影響很大，濃度過(guò)高可降低PCR擴增的特異性，濃度過(guò)低則影響PCR擴增產(chǎn)量甚至使PCR擴增失敗而不出擴增條帶。
　　反應體積的改變：通常進(jìn)行PCR擴增采用的體積為20ul、30ul、50ul。或100ul，應用多大體積進(jìn)行PCR擴增，是根據科研和臨床檢測不同目的而設定，在做小體積如20ul后，再做大體積時(shí)，一定要模索條件，否則容易失敗。
　　物理原因：變性對PCR擴增來(lái)說(shuō)相當重要，如變性溫度低，變性時(shí)間短，極有可能出現假陰性;退火溫度過(guò)低，可致非特異性擴增而降低特異性擴增效率退火溫度過(guò)高影響引物與模板的結合而降低PCR擴增效率。有時(shí)還有必要用標準的溫度計，檢測一下擴增儀或水溶鍋內的變性、退火和延伸溫度，這也是PCR失敗的原因之一。
　　靶序列變異：如靶序列發(fā)生突變或缺失，影響引物與模板特異性結合，或因靶序列某段缺失使引物與模板失去互補序列，其PCR擴增是不會(huì )成功的。
假陽(yáng)性
　　出現的PCR擴增條帶與目的靶序列條帶一致，有時(shí)其條帶更整齊，亮度更高。
　　引物設計不合適：選擇的擴增序列與非目的擴增序列有同源性，因而在進(jìn)行PCR擴增時(shí)，擴增出的PCR產(chǎn)物為非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出現假陽(yáng)性。需重新設計引物。
　　靶序列或擴增產(chǎn)物的交叉污染：這種污染有兩種原因：
    一是整個(gè)基因組或大片段的交叉污染，導致假陽(yáng)性。這種假陽(yáng)性可用以下方法解決：①操作時(shí)應小心輕柔，防止將靶序列吸入加樣槍內或濺出離心管外;②除酶及不能耐高溫的物質(zhì)外，所有試劑或器材均應高壓消毒。所用離心管及樣進(jìn)槍頭等均應一次性使用；③必要時(shí)，在加標本前，反應管和試劑用紫外線(xiàn)照射，以破壞存在的核酸。
    二是空氣中的小片段核酸污染，這些小片段比靶序列短，但有一定的同源性。可互相拼接，與引物互補后，可擴增出PCR產(chǎn)物，而導致假陽(yáng)性的產(chǎn)生，可用巢式PCR方法來(lái)減輕或消除。
出現非特異性擴增帶
　　PCR擴增后出現的條帶與預計的大小不一致，或大或小，或者同時(shí)出現特異性擴增帶與非特異性擴增帶。非特異性條帶的出現，其原因：
    一是引物與靶序列不*互補、或引物聚合形成二聚體。
    二是Mg2+離子濃度過(guò)高、退火溫度過(guò)低，及PCR循環(huán)次數過(guò)多有關(guān)。
其次是酶的質(zhì)和量，往往一些來(lái)源的酶易出現非特異條帶而另一來(lái)源的酶則不出現，酶量過(guò)多有時(shí)也會(huì )出現非特異性擴增。其對策有：①必要時(shí)重新設計引物。②減低酶量或調換另一來(lái)源的酶。③降低引物量，適當增加模板量，減少循環(huán)次數。④適當提高退火溫度或采用二溫度點(diǎn)法93℃變性，65℃左右退火與延伸。
出現片狀拖帶或涂抹帶
　　PCR擴增有時(shí)出現涂抹帶或片狀帶或地毯樣帶。其原因往往由于酶量過(guò)多或酶的質(zhì)量差，dNTP濃度過(guò)高，Mg2+濃度過(guò)高，退火溫度過(guò)低，循環(huán)次數過(guò)多引起。其對策有：①減少酶量，或調換另一來(lái)源的酶。②減少dNTP的濃度。③適當降低Mg2+濃度。④增加模板量，減少循環(huán)次數。
 PCR污染與對策 
    PCR反應的zui大特點(diǎn)是具有較大擴增能力與*的靈敏性，但令人頭痛的問(wèn)題是易污染，極其微量的污染即可造成假陽(yáng)性的產(chǎn)生。
污染原因
　 一標本間交叉污染:標本污染主要有收集標本的容器被污染，或標本放置時(shí)，由于密封不嚴溢于容器外，或容器外粘有標本而造成相互間交叉污染;標本核酸模板在提取過(guò)程中，由于吸樣槍污染導致標本間污染;有些微生物標本尤其是病毒可隨氣溶膠或形成氣溶膠而擴散，導致彼此間的污染。
　 二PCR試劑的污染:主要是由于在PCR試劑配制過(guò)程中，由于加樣槍、容器、雙蒸水及其它溶液被PCR核酸模板污染.
　 三PCR擴增產(chǎn)物污染:這是PCR反應中zui主要zui常見(jiàn)的污染問(wèn)題，因為PCR產(chǎn)物拷貝量大一般為1013拷貝/ml，遠遠高于PCR檢測數個(gè)拷貝的極限，所以極微量的PCR產(chǎn)物 污染，就可造成假陽(yáng)就可形成假陽(yáng)性。
　還有一種容易忽視，zui可能造成PCR產(chǎn)物污染的形式是氣溶膠污染;在空氣與液體面摩擦時(shí)就可形成氣溶膠，在操作時(shí)比較劇烈地搖動(dòng)反應管，開(kāi)蓋時(shí)、吸樣時(shí)及污染進(jìn)樣槍的反復吸樣都可形成氣溶膠而污染.據計算一個(gè)氣溶膠顆粒可含48000拷貝，因而由 其造成的污染是一個(gè)值得特別重視的問(wèn)題。
 　四實(shí)驗室中克隆質(zhì)粒的污染:在分子生物學(xué)實(shí)驗室及某些用克隆質(zhì)粒做陽(yáng)性對照的檢驗室，這個(gè)問(wèn)題也比較常見(jiàn)。因為克隆質(zhì)粒在單位容積內含量相當高，另外在純化過(guò)程中需用較多的用具及試劑，而且在活細胞內的質(zhì)粒，由于活細胞的生長(cháng)繁殖的簡(jiǎn)便性及具有很強的生命力，其污染可能性也很大。
污染的監測
　一個(gè)好的實(shí)驗室，要時(shí)刻注意污染的監測，考慮有無(wú)污染是什么原因造成的污染，以便采取措施，防止和消除污染。
對照試驗
　1.陽(yáng)性對照:在建立PCR反應實(shí)驗室及一般的檢驗單位都應設有PCR陽(yáng)性對照，它是PCR反應是否成功、產(chǎn)物條帶位置及大小是否合乎理論要求的一個(gè)重要的參考標志。陽(yáng)性對照要選擇擴增度中等、重復性好，經(jīng)各種鑒定是該產(chǎn)物的標本，如以重組質(zhì)粒為陽(yáng)性對照，其含量宜低不宜高100個(gè)拷貝以下，但陽(yáng)性對照尤其是重組質(zhì)粒及高濃度陽(yáng)性標本，其對檢測或擴增樣品污染的可能性很大。因而當某一PCR試劑經(jīng)自己使用穩定，檢驗人員心中有數時(shí)，在以后的實(shí)驗中可免設陽(yáng)性對照。
　2.陰性對照:每次PCR實(shí)驗務(wù)必做陰性對照。它包括①標本對照:被檢的標本是血清就用鑒定后的正常血清作對照;被檢的標本是組織細胞就用相應的組織細胞作對照。②試劑對照:在PCR試劑中不加模板DNA或RNA，進(jìn)行PCR擴增，以監測試劑是否污染。
　3.重復性試驗
  4.選擇不同區域的引物進(jìn)行PCR擴增
防止污染的方法
 1.合理分隔實(shí)驗室:將樣品的處理、配制PCR反應液、PCR循環(huán)擴增及PCR產(chǎn)物的鑒定等步驟分區或分室進(jìn)行，特別注意樣本處理及PCR產(chǎn)物的鑒定應與其它步驟嚴格分開(kāi)。能劃分①標本處理區;②PCR反應液制備區;③PCR循環(huán)擴增區;④PCR產(chǎn)物鑒定區。其實(shí)驗用品及吸樣槍?xiě)瑢?shí)驗前應將實(shí)驗室用紫外線(xiàn)消毒以破壞殘留的DNA或RNA。
 2.吸樣槍:吸樣槍污染是一個(gè)值得注意的問(wèn)題。由于操作時(shí)不慎將樣品或模板核酸吸入槍內或粘上槍頭是一個(gè)嚴重的污染源，因而加樣或吸取模板核酸時(shí)要十分小心，吸樣要慢，吸樣時(shí)盡量一次性完成，忌多次抽吸，以免交叉污染或產(chǎn)生氣溶膠污染。
 3.預混和分裝PCR試劑:所有的PCR試劑都應小量分裝，如有可能，PCR反應液應預先配制好，然后小量分裝，-20℃保存。以減少重復加樣次數，避免污染機會(huì )。另外，PCR試劑，PCR反應液應與樣品及PCR產(chǎn)物分開(kāi)保存，不應放于同一冰盒或同一冰箱。
 4.防止操作人員污染，使用一次性手套、吸頭、小離心管應一次性使用。
 5.設立適當的陽(yáng)性對照和陰性對照，陽(yáng)性對照以能出現擴增條帶的zui低量的標準病原體核酸為宜，并注意交叉污染的可能性，每次反應都應有一管不加模板的試劑對照及相應不含有被擴增核酸的樣品作陰性對照。
 6.減少PCR循環(huán)次數，只要PCR產(chǎn)物達到檢測水平就適可而止。
 7.選擇質(zhì)量好的Eppendorf管，以避免樣本外溢及外來(lái)核酸的進(jìn)入，打開(kāi)離心管前應先離心，將管壁及管蓋上的液體甩至管底部。開(kāi)管動(dòng)作要輕，以防管內液體濺出。